编辑：虞凤

1.免疫荧光技术的概念

    免疫荧光技术（Immu nofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种[1]。将抗原或抗体用荧光素进行标记，标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分作若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染,并且大多操作简便,便于推广[2]。由于一般荧光测定中的本底较高等问题,荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

2.荧光免疫技术的原理

    免疫荧光技术的基本原理就是将荧光物质与待测物通过化学反应以共价键连接，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等仪器的检测，达到定位、示踪、含量测定等目的，并被广泛地应用于生物化学、免疫学、分子生物学、病理学和诊断学等方面。

3.荧光免疫技术分类 

   （1）荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。 

   （2）免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 

4.荧光标记

    荧光物质受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当激发态恢复至基态时，发出荧光。荧光的特点是灵敏、特异、准确、快速。可用于标记的荧光素有：异硫氰酸荧光素(FITC )、四乙基罗丹 明(RIB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC )，其中应用最广的是FITC”。对于荧光标记示踪的原理，目前常见的有以下两种情况：一是利用环境的差异而引起荧光物质的荧光发生变化，观测这种变化，间接的达到示踪目的，如：4-十七烷基-7-羟基香豆素是一种pH敏感的荧光探针，主要作用于细胞膜表面，随着细胞所处环境pH的改变而引起荧光强度的变化，观测这种变化，可以研究阳离子脂类与细胞膜的作用；二是用荧光物质标记所要研究的物质，通过监测荧光物质达到靶向追踪的目的。

5.荧光抗体技术

5.1标本的制备

    荧光抗体技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性 ，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。

常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片 。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上 1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装，置-10℃保存或立即使用。

5.2荧光抗体染色

于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体 ，置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般25℃-37℃30min不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜,用PBS充分洗涤,干燥。

6.荧光免疫技术的临床应用

6.1荧光抗体技术的应用

    自身抗体检测　荧光抗体技术可用于检测血清抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体，辅助诊断自身免疫性疾病。

    病原体检测　荧光抗体技术可快速鉴定病原体并可检测血清中抗体，用于疾病诊断、流行病学调查和临床回顾诊断。

    免疫病理检测　荧光抗体技术可用于组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测及肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定。

    细胞表面抗原和受体检测　荧光抗体技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。

    荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析。在这种分析法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射后发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。

6.2 荧光免疫测定的应用

    目前，时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定都有全自动化测试的分析仪器，这些仪器具有试剂和样本条码识别系统，能自动加样、温育、洗涤、分离、测定荧光强度、处理数据和报告结果。

     时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标志物、病原体抗原／抗体等；荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定，目前已有数十种治疗药物和成瘾药物、维生素、激素及常规生化项目可用荧光偏振免疫测定进行分析和定量测定；荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子等。 

     荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本。而是将游离细胞作荧光抗体特意染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理数据。这种方法可用于检测细胞大小、粘滞度等，更常用于T细胞亚群等的检测[3-5]。

参考文献：

[1] 贺天辉.免疫学检验技术的研究进展,中国现代医,201l.49 (6):14-l5.

[2] 赵晨,张亮,倪原.荧光偏振技术在生命科学中的研究进展现代生物医学进展,2010,16 (10):3154-3156.

[3] 戴维德,顾瑛,刘凡光,等.荧光探针在光动力疗法亚细胞损伤位点研究中的应用[J].激光生物学报,2004,13（2）:148-153.

[4] 王浩丹,周申,主编.生物医学标记示踪技术[M].北京:人民卫生出版社,1995:69-96.

[5] 韩俊伟,杜海燕.免疫荧光技术原理及应用[J].河南畜牧兽医，2014，35（11）：9-10.