编辑：钱亚如

随着免疫学技术及全自动生化分析仪技术的日趋完善，免疫透射比浊法试剂在全自动生化仪上应用逐渐成熟。由于该方法操作简便、自动化和高稳定性使其成为目前临床生化检测中最常用的技术之一。 大量的以往依靠专用免疫学检测仪器执行的检测项目也逐步转移到全自动生化仪上完成。为帮助基层试验室操作者对相关知识的了解，并正确开展相关检测，特对免疫透射比浊法原理、主要影响因素和应用注意事项等知识进行简单介绍。

1.免疫透射比浊法原理

免疫透射比浊法的原理是：可溶性抗原抗体在液相中特异结合产生一定大小的复合物，当一束光线通过这些复合物时，在1800角（即在直射角度）上测定光透射强度，由于复合物的散射和遮挡，致使透光度减弱（见图1）。在一定条件下透射光减弱的程度（吸光度的增加）和液相中复合物的量成比例从而得出被测溶液中抗原或抗体的浓度[1]。

图1. 免疫透射比浊法原理示意图

2.免疫透射比浊法改进

    长期以来，人们普遍认为免疫透射比浊法的敏感性不够理想，检测范围不够宽，原因是免疫复合物颗粒太小，阻挡不了光线的通过；或是免疫复合物的数量太少，其浊度变化对光通量的透过影响不大，特别是在低浓度时更加明显[2]。

近年来，发展起来的胶乳增强免疫透射比浊法（Particle Enhanced Turbidimetric Assay，简称：PETIA 或Latex Enhanced Turbidimetry）大大缓解了这一难题[3-5]。该方法是将抗体连接在微小的胶乳颗粒（粒子直径从20nm－4μm）上，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，检测的灵敏度得到了极大的改善，检测灵敏度最高可达到1.0ng/ml，可以作为多克隆抗体和单克隆抗体的载体。纳米级粒子的推出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。

特别是双胶乳颗粒连接的双抗体技术（DuREL，dual radius latex enhanced technology）最近也得以应用于免疫透射比浊法，其中大胶乳颗粒包被了高反应性抗体，以提高分析敏感性；小胶乳颗粒包被了低反应性抗体，以此来扩展测量范围，使得检测敏感性及检测范围大大改善[2]。以C 反应蛋白( CRP) 试剂盒为例，第1代试剂为传统的免疫透射比浊法，其检测范围为5～250 mg /L； 第2 代试剂采用PETIA法制备的超敏CRP，其检测灵敏度可达0.3mg/L；而第3 代试剂则为双胶乳颗粒连接的双抗体技术（全程CRP），其检测范围为0.3～350 mg /L，分析敏感性与测量范围均大大增加。

PETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。国外已有多家公司提供纳米级表面修饰的微球粒子原料，并广泛应用于PETIA。

3. 免疫透射比浊法检测的主要影响因素

     免疫比浊法检测都是通过抗原抗体的结合来测定样品中待测物质的浓度的，那其必然受到抗体（或抗原）、缓冲系统和波长的影响。下面就这些主要因素进行介绍。

3.1 抗体（或抗原）的质量

    免疫浊度测定对抗体的质量要求较高，抗体要特异性强，即只与相应抗原反应，与其他抗原绝无交叉反应。且效价高，大于1:20，亲和力强，这样可加快抗原、抗体反应，使抗原、抗体复合物牢固不易解离[6]。因此，可以说拥有的抗

体质量是决定比浊结果的重要原因。抗原和抗体的制备，无论是使用抗原作为试剂检测待测标本中的特异性抗体，如测定抗链球菌溶血素 “O”；还是使用抗体作为试剂检测待测标本中的抗原，如各种特定蛋白，都要求它们达到一定的纯度，具有特异性和反应的专一性。单克隆抗体的特异性显然远远高于多克隆抗体，基因工程制备的第三代抗体，又比通过生物学方法制备的抗体要好[7]。

3.2 抗原抗体的比例

在免疫浊度测定中，免疫复合物微粒的大小与反应体系中抗原、抗体的比例关系密切，抗原、抗体的比例是浊度形成的关键因素。当抗原、抗体比例恰当时，二者全部结合，既无抗原过剩，又无抗体过剩，这时免疫复合物的形成和解离达到平衡。当抗原过量时，形成的免疫复合物分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射减少，形成高剂量钩状效应图。当抗体过量时，复合物的形成随着抗原量的增加而增加，当抗原、抗体比例达到最佳时免疫复合物的量达到高峰，这就是经典的Heidelberger曲线理论图（见图2）。为此，免疫比浊法的基本原则就是在反应体系中保持抗体过量，如抗原过量则引起测量失败。

图2. Heidelberger曲线理论图

3.3 缓冲系统

    1、PH值。抗原抗体一般需要相对温和PH。pH6.5—8.5时抗原、抗体亲和力大，超过这个范围不易形成免疫型复合物，甚至可引起免疫复合物解离；pH太高或太低易引起蛋白质变性，形成伪浊度。

    2、离子强度。电解质的性质和强度影响免疫复合物的形成和稳定性：离子浓度可以直接影响Ag和Ab的结合。在一定范围内，离子强度大，免疫复合物形成快。但离子强度过高可引起蛋白质盐析，形成伪浊度。离子的种类也可影响复合物的形成，由慢到快可按顺序排列为：SCN-、c1O4、Cl、F、SO2-、H2PO4-、HPO42-。因此，常用磷酸盐缓冲液作为免疫浊度测定的反应液。

    3、入射光波长。无论是透射比浊还是散射比浊，入射光波长均影响浊度测定的灵敏度。若血清成分能吸收部分入射光，透射比浊法会误测为抗原的高浓度，散射比浊法会误测为抗原的低浓度。因此浊度测定的波长选择很重要，以江苏英诺华医疗技术有限公司生产的D系列全自动生化仪为例，普通免疫比浊法的波长一般选择340nm；而胶乳增强免疫比浊法的波长根据抗体交联的胶乳大小选择不同波长，通常会选择578nm、620nm或670nm。

    4、伪浊度。指非待测抗原、抗体特异结合生成的免疫复合物形成的浊度，可导致抗原检测结果假性升高。伪浊度形成的原因有标本混浊、高血脂、标本长期保存或反复冻融，处理不当；试剂中抗体效价低于1:20可导致伪浊度增加；抗血清含有交叉反应性抗体，聚乙二醇(PEG)浓度过高引起血清中杂蛋白的非特异性共沉淀，浊度增加[8]；试剂污染(如细菌)和变质；器材不够清洁，尤其是比色杯、尘埃污染等；其他因素还有缓冲液的离子类型与强度、pH值及反应温度等都会对浊度形成影响。

4．免疫透射比浊法的特定和临床应用

    近年来，免疫透射比浊法自身改进使其在生化分析仪上得到广泛的应用。其主要的优点有一下几个：

     1、抗干扰能力强：免疫复合物、免疫球蛋白聚集、脂蛋白以及胆红素或游离血红蛋白等都可对光散射或光透射分析结果产生干扰。而免疫透射比浊法所采用的全自动生化分析仪可联合应用双波长检测，辅助检测点的设置，样本自动稀释，与样本空白对照检测，有助于最小化这些因素对检测的影响。因此，免疫透射比浊法的抗干扰能力较强[2]。

     2、操作方便：可应用于全自动生化仪。自动化程度高，操作简便，仪器技术成熟，稳定性好，检测结果10min内得到。

     3、成本低，易普及：免疫透射比浊法的试剂相对成本较低，且试剂开启后稳定，校准周期较长，故总体消耗成本较低。

     综上所述，，免疫透射比浊法具有更优的精密度、相似的分析敏感性和检测范围、良好的相关性、较小的系统误差、较强的抗干扰能力，且更加实用和便利，、适合各种有全自动生化分析仪的医院，完全符合实验室常规检测的要求。因此，免疫透射比浊法在临床实验室中具有广泛的应用价值与优势[9]。

参考文献：

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[2] 彭凤,于嘉屏,应春妹. 免疫透射比浊测定技术的进展和分析特性[J]. 检验医学,2012.27.(4):252-256.

[3] Al-Turkmani MR，Law T，Kellogg MD． Performance evaluation of a particle-enhanced turbidimetric cystatin C assay on the Hitachi 917 analyzer［J］．Clin Chim Acta，2008，398( 1-2) : 75-77．

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[9] 孙立芳,赵静.浅谈免疫比浊法技术优势[J]中国敏康医学,2012.24.(23):2870-2872.